（1）濃度和作用時間：隨著濃度的增加和作用時間的延長，殺菌作用增強。但質量分數低于2%的戊二醛溶液，無論怎樣延長殺菌時間，也不能取得可靠的殺細菌芽孢效果。因此，殺滅細菌芽孢需用質量分數大于2%的戊二醛溶液。
（2）溶液酸堿度：酸性戊二醛的殺菌作用明顯低于堿性戊二醛，但隨溫度升高差異逐漸減小。在pH4.0～9.0范圍內，隨著pH值的增加殺菌作用增強；pH7.5～8.5時殺菌作用最強；pH＞9時，戊二醛迅速聚合，殺菌作用迅速喪失。
（3）溫度：在較低溫度下也有殺菌作用。隨溫度升高，戊二醛殺菌作用增強。
（4）有機物：有機物使殺菌作用減弱，但有機物對戊二醛殺菌作用的影響比其他消毒劑小，20%小牛血清和1%全血對2%戊二醛的殺菌效果基本無影響。

（5）非離子表面活性劑及其他理化因子的增效作用：聚氧乙烯脂肪醇醚為非離子表面活性劑，在戊二醛溶液中加入0.25%聚氧乙烯脂肪醇醚配制成的強化酸堿性戊二醛，穩定性和殺菌效果都明顯提高。超聲波、遠紅外線與戊二醛有協同殺菌作用。